蛋白樣品制備

Western-Blot樣品制備是實驗的第一步，也是關(guān)鍵的一步，只有在獲得高質(zhì)量的總蛋白的前提下才有可能通過后續(xù)步驟檢測到目的蛋白的表達(dá)；不同的樣本，提取蛋白的方法略有不同，下面簡單介紹不同樣本蛋白質(zhì)的提取操作。

1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷；

2.吸取細(xì)胞懸液，低速離心收集細(xì)胞，在1.5ml離心管中加入預(yù)冷的PBS，漩渦震蕩，500 xg離心2~3min，清洗細(xì)胞，吸去上清，剩余與細(xì)胞體積相同的PBS，漩渦震蕩重懸細(xì)胞；

3.按照下表1-1中相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液，漩渦震蕩裂解細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量和裂解液須保證對應(yīng)關(guān)系，以達(dá)到最佳提取效率)；

4.將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中,14000~16000 xg離心30s取出；

5.立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實驗。

1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷；

2.將預(yù)冷的PBS直接加入培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細(xì)胞，吸取上清；

3.按照表1-2中將相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液均勻的加入整個器皿表面，用移液器吹打幾次，將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中，14000~16000 xg離心30s取出；(如提取濃度不佳，可減少裂解液使用量）；

4.立刻將收集管放置于冰上，棄去離心管柱，蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實驗。

以下步驟是從15-20mg組織中提取，如果起始量較大或較小，需調(diào)整相應(yīng)裂解液的用量比例：

1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷；

2.將15-20mg新鮮/冷凍組織放置于離心管柱上，用塑料棍向下扭轉(zhuǎn)反復(fù)研磨50-60次，加入200μl細(xì)胞裂解液，繼續(xù)研磨30-60次；（注意：組織用量不要過量，無需過度研磨，裂解液可分兩次加入以得到最佳效果；塑料研磨棒可以重復(fù)使用，用蒸餾水徹底沖洗干凈，用紙巾擦干）；

3.蓋上蓋子室溫孵育1-2min，14000-16000 xg離心1-2min取出，收集管里的上清是抽提的總蛋白。

注：上述操作步驟及試劑用量均作為參考，具體用量以實際實驗操作及產(chǎn)品說明書為準(zhǔn)。

1.收集到的臨床組織標(biāo)本首先應(yīng)盡快去除脂肪和壞死組織，并將蘸有的血液清洗干凈，否則影響提取蛋白定量的質(zhì)量和濃度；整理干凈的標(biāo)本立即放入液氮中凍存，至少應(yīng)盡快放入-80℃冰箱，盡量減少蛋白的降解；

2.裂解細(xì)胞時，可將加了裂解液的樣品置于冰浴上超聲，以加快細(xì)胞的裂解，超聲間隔時間應(yīng)長于或至少等于超聲工作時間，以使樣本充分冷卻，建議工作時間10~20s，超聲功率設(shè)置時不能過大，過大會造成蛋白質(zhì)焦化；

3.制備好的蛋白樣品推薦根據(jù)每次實驗的用量進(jìn)行分裝，做好標(biāo)記，包括樣品名稱、提取日期等后存入-80℃冰箱備用，以免反復(fù)凍融加速蛋白的降解，凍存的蛋白保存時間不宜超過1個月。